Jakie odczynniki są stosowane w mikroskopii elektronowej?

Badanie za pomocą mikroskopów elektronowych daje szerokie możliwości obserwacji składu chemicznego, struktury preparatów i materiałów oraz ich powierzchni. Dzięki różnym rodzajom mikroskopów wykorzystujących ukierunkowaną wiązkę elektronów można analizować obiekty od rozmaitych stopów metali po preparaty biologiczne – tkanki, bakterie czy substancje pochodzenia organicznego.

Do prawidłowej obserwacji konieczne jest odpowiednie przygotowanie próbek. W przypadku obiektów biologicznych niezbędne będzie użycie różnych typów odczynników chemicznych. Tak, jak w przypadku preparatów do obserwacji optycznych umożliwiają one zachowanie materiału w niezmienionym stanie. Przyjrzyjmy się bliżej temu, jak przebiega obserwacja z wykorzystaniem mikroskopu elektronowego i zobaczmy, z jakich preparatów korzysta się przy przygotowywaniu próbek biologicznych.

Jak wygląda obserwacja przy użyciu mikroskopu elektronowego?

Mikroskopia elektronowa pozwala na znacznie poszerzenie możliwości badawczych i obserwację obiektów, których struktura nie mogłaby zostać poznana przy wykorzystaniu tradycyjnych metod optycznych. Dzięki wykorzystaniu wiązki promieniowania o bardzo niewielkiej długości fali mamy możliwość tworzenia niezwykle dokładnego obrazu struktury materiału na poziomie atomowym. Emitowana wiązka elektronów pierwotnych wchodzi w interakcje z próbką, będąc częściowo absorbowana, wywołując emisję promieniowania, odbijając się albo przenikając przez materiał. W wyniku oddziaływań powstają różne rodzaje promieniowania, m.in. fluorescencyjnego, rentgenowskiego czy elektronów wtórnych. Ponieważ cechy powstającego spektrum promieniowania zależą od charakterystyki badanego obiektu, na podstawie danych o wywołanej reakcji, mierzonej przy pomocy odpowiednich detektorów można wygenerować obraz obserwowanej powierzchni.

Do badań powierzchni wykorzystuje się wiązkę elektronową, która pozwala na dokonywanie obserwacji w bardzo dużej zdolności rozdzielczej. W mikroskopach tego typu wiązka jest wytwarzana przez działo elektronowe, po czym przyspieszana za sprawą pola elektromagnetycznego oraz skupiana soczewkami elektromagnetycznymi do bardzo małej średnicy. Wiązka elektronów napotykając obiekt, częściowo przez niego przenika, a częściowo ulega odbiciu. W przypadku mikroskopów elektronowych typu TEM (Transmission Electron Microscope, czyli transmisyjny mikroskop elektronowy) detektory analizują charakterystykę elektronów, które przeszły przez próbkę. Jeśli używane są mikroskopy elektronowe typu SEM (Scanning Electron Microscope, czyli skaningowy mikroskop elektronowy) bada się elektrony powstałe w wyniku interakcji próbki i wiązki pierwotnej. Użycie mikroskopów SEM daje możliwość obserwacji z rozdzielczością sięgającą 1 nanometra, a przy wykorzystaniu mikroskopów TEM aż 0,1 nanometra.

Choć obserwacje za pomocą mikroskopów elektronowych dają możliwość uzyskania niezwykle precyzyjnych informacji, to specyfika ich działania sprawia, że dużym wyzwaniem staje się odpowiednie przygotowanie próbki. Analogicznie jak w przypadku obserwacji pod mikroskopem optycznym próbka musi być bowiem na tyle cienka, by promieniowanie, tak jak fale świetlne przy mikroskopach optycznych, mogło przez nią przeniknąć. Wymaga to przygotowania materiału o niezwykle małej grubości, a jednocześnie nienaruszenia jego struktury wewnętrznej.

Przygotowanie próbki do badania mikroskopowego

Przygotowanie próbki do obserwacji pod mikroskopem elektronowym wymaga podobnych zabiegów, jak przy preparowaniu materiału do obserwacji optycznych, choć wymaga zupełnie innych preparatów i urządzeń. W tym przypadku zamiast klasycznych mikrotomów tnących obiekt mechanicznie za pomocą noży korzysta się z ultramikrotomów, pozwalających na osiągnięcie grubości rzędu nawet 1 nanometra. Tak niezwykłe rezultaty są możliwe dzięki wykorzystaniu specjalnych noży diamentowych albo promienia lasera.

Przygotowanie próbki do badania pod mikroskopem elektronowym przebiega w kilku etapach i wymaga kolejnego użycia różnych typów odczynników. Pierwszym etapem jest utrwalanie pobranego materiału w aldehydzie glutarowym albo jego mieszance z formaldehydem. Dla zapewnienia pH możliwie zbliżonego do naturalnego dla danej badanej próbki należy wykorzystać odpowiedni preparat w postaci np. buforu kakodylowego, fosforanowego czy Tris/HCl, albo HEPES/HCl, w którym rozpuszcza się utrwalacz.

Po procesie utrwalania prowadzonym nierzadko w obniżonej temperaturze dla zwolnienia procesów metabolicznych niezbędne jest wypłukanie utrwalacza za pomocą użytego wcześniej buforu, czyli np. kakodylanu sodu. Następnym krokiem jest przeprowadzanie utrwalania wtórnego w postaci osmowania w czterotlenku osmu rozpuszczonym w buforze lub wodzie destylowanej. Po osmowaniu wykonuje się odwadnianie alkoholem lub acetonem. Dla ochrony próbki przed uszkodzeniami mechanicznymi zatapia się ją w żywicy epoksydowej lub akrylowej.

Ostatnim etapem jest trymowanie próbki oraz umieszczenie jej w ultramikrometrze w celu pocięcia. Próbki w zależności od swego rodzaju są umieszczane na specjalnych siatkach miedzianych albo złotych lub niklowych z odpowiednim dla samego preparatu i celu badania filmem, np. krzemionkowym bądź węglowym albo odpowiednią membraną. Próbka może też być dodatkowo skontrastowana roztworem octanu uranylu albo cytrynianu ołowiu.